DYSKUSYJNE FORUM PSZCZELARSKIE POD PATRONATEM PASIEKI MICHAŁÓW

Petrus

Tekst pochodzi ze zbioru moich autorskich artykułów, dotychczas nigdzie nieopublikowanych

Odkrycia w Nowej Funlandii

Warroza jest wciąż groźną chorobą pasożytniczą. Wiele wskazuje na to, że to właśnie roztocze Varroa Destructor w dużej mierze jest odpowiedzialne za znikanie całych kolonii pszczelich w dość tajemniczy, szybki i cichy sposób. Roztocza warrozy są przenośnikami wielu wirusów, które zwiększają śmiertelność pszczół na całym świecie. Na drodze zagranicznych badań i nowych osiągnięć, które uważnie śledzę, nadal przewijają się hasła związane z warrozą i jej nieumiejętnym zwalczaniem. To główna przyczyna słynnego syndromu pustego ula, czy CCD zaraz obok toksycznych środków ochrony roślin. Niedawno przeczytałem artykuł na zagranicznym portalu naukowym o nowofundlandzkich pszczołach, które są wolne od tych pasożytów. Potwierdzono, że Wyspa Nowej Funlandii i Labradoru, a także Kanada wolne są od warrozy. Przyjrzyjmy się bliżej temu odkryciu.

Naukowcy podają, że to osiągnięcie daje niepowtarzalną okazję do zbadania faktycznego stanu zdrowia pszczół miodnych. Inwazyjne patogeny, takie jak Nosema ceranae, Varroa Destructor i inne roztocza wywołują wysokie straty ekonomiczne w pszczelim przemyśle poprzez upadki rodzin i zmniejszoną wydajność miodną ocalałych pni. Nancy Ostiguy, profesor entomologii w Penn State twierdzi, że powyższe pasożyty zagrażają globalnemu bezpieczeństwu żywności z powodu ograniczonego zapylania w branży rolniczej.

Ciężko jest określić, które gatunki pasożytów wywołują największe upadki. Prof. Ostiguy i jej zespół odnaleźli obszar geograficzny, w Nowej Funlandii, na którym pasożyty inwazyjne jak Varroa Destructor i Nosema Ceranae, praktycznie nie istnieją. Zespół badawczy w swoim doświadczeniu użył molekularnych, najnowszych technik z wykorzystaniem metody skanowania optycznego by móc wykryć obecność wirusów, roztoczy (w tym Varroa Destructor) i sporów nosemozy w nowofundlandzkich rodzinach pszczelich, prowadzonych przez lokalnych pszczelarzy.

Naukowcy następnie oszacowali ilość rodzin, które potencjalnie mogłyby być zainfekowane. Zestawiono rodziny, w których wykryto specjalnymi markerami poszczególne patogeny i sporządzono protokoły chorobowe, w których precyzyjnie określono obecność lub brak wirusów czy pasożytów. W koloniach pszczelich w Nowej Fundlandii, naukowcy odkryli spory Nosema Apis, które zostały wyparte przez spory Nosema Ceranae i inne patogeny takie jak: wirus choroby czarnych mateczników (BQCV) i wirus zdeformowanych skrzydeł (DWV).
"Pomimo obecności tych patogenów, straty w nowofundlandzkich pasiekach są stosunkowo niskie – podobne są do wskaźników śmiertelności zgłaszanych w Stanach Zjednoczonych przed inwazją Varroa destructor" relacjonuje prof. Ostiguy.

Zespół odkrył również, że nowofundlandzkie pszczoły, które były teoretycznie zdrowe cierpiały od dłuższego czasu na chorobę K-Wing, czyli opisowy stan asymetrycznego ułożenia skrzydeł. Potwierdzono, że syndrom ten, nie był wcześniej znany i powiązany z żadnym znanym patogenem. Naukowcy wykryli istotny pozytywny związek między obecnością wirusa choroby czarnych mateczników a właśnie chorobą K-Wing.
K-Wing jest klasycznym symptomem Trachael Mites, znanego u nas pod nazwą Acarapis Woodi czyli świdraczka pszczelego wywołującego akariozę. Pasożyt ten, przebywa w tchawkach pszczół miodnych i odżywia się hemolimfą. Chorobę tę, zwalcza się poprzez odparowanie mentolu bądź kwasu mrówkowego. Według prof. Ostiguy interesujące jest to, że jedynym, klinicznym objawem wcześniej związanym z wirusem choroby czarnych mateczników było masowe zamieranie czerwia. U nas, charakterystycznym objawem jest „skakanie” pszczół miodnych niczym koniki polne. Przy zjawisku K-Wing, morfologia skrzydła pozostaje normalna, jednak skrzydła są utrzymane niesymetrycznie do tyłu z najmniejszym tylnym i niesparowanym przednim skrzydłem.

Dodatkowo, zespół pod kierownictwem prof. Ostiguy udowodnił znaczący, negatywny związek między wirusem choroby czarnych mateczników a wirusem zdeformowanych skrzydeł.

Z przetłumaczonego abstraktu protokołu badań, dowiedziałem się, że przebadano wizualnie metodą przesiewową 55 nowofundlandzkich kolonii pszczelich. Sprawdzano między innymi ich siłę i ewentualne objawy chorobowe. Przypadki wykrycia K-Wing pojawiły się w 40 na 55 rodzin (72,7%), a populacja tego schorzenia wynosiła nieco ponad 5%. Wykonane zrzuty ze skanowania rodzin wykluczyły obecność warrozy, potwierdziła się niewielka ilość ulowych insektów i roztoczy: Aehina tumida, acarapis woodi i Tropilaelaps spp. Ectoparasitic. Po molekularnym przeskanowaniu kontrolnej grupy uli (w liczbie 23) nie wykryto izraelskiego wirusa paraliżu pszczół, kaszmirskiego wirusa pszczół ani wirusa choroby woreczkowej. 16 z 23 rodzin (70%) wykazało dodatni wynik na obecność wirusa czarnych mateczników i 21 rodzin (91,3%) – na obecność wirusa zdeformowanych skrzydeł (DWV). Nie wykryto natomiast Nosemy Ceranae w zrzutach skanowania molekularnego, natomiast odnaleziono spory jej odpowiednika – Nosema Apis aż w 53 rodzinach (co daje 96,4%).

W rodzinach z warrozą często występuje pozytywny związek między dwoma wirusami. Wirus czarnych mateczników był połączony pozytywnie z siłą kolonii, zjawiskiem K-Wing i wirusem zdeformowanych skrzydeł. W momencie kiedy rodzina wolna jest od warrozy przeprowadzane jest molekularne skanowanie na obecność wirusów, Nosemy Ceranae i następuje wizualne zrzutowanie na inne pasożyty zewnątrz szkieletowe.

Z wielu powodów wyspa Nowej Funlandii i Kanady pozostaje nadal wolna od Nosemy Ceranae, warrozy i wielu zewnątrz szkieletowych pasożytów pszczół miodnych. Nieobecność ważnego roznosiciela tych patogenów tworzy szczelną, sterylną izolację. Łatwo można sprawdzać przestrzeganie restrykcji dotyczących importu przez lokalnych pszczelarzy. W rodzinach pszczelich wykonano molekularnie badanie na obecność 5 wirusów i nosemozy. Naukowcy przewidywali, że objawy infekcji wirusowych w nowofundlandzkich pszczołach mogą występować rzadziej niż na terenach gdzie roztocza warrozy są powszechne. W czerwcu 2010 r zespół badawczy przeprowadził 5 operacji na pszczołach miodnych w celu określenia ilości pasożytów. Pobrano w tym celu próbki do molekularnego oszacowania ilości wirusów i sporów nosemy. Próbki pobrano z 55 na 115 uli (47,8%) w Nowej Funlandii. Przy badaniu zastosowana została 4-stopniowa skala: 0 wskazywało na brak lub ledwie wykrywalną ilość patogenów, 1 - na wykrywalność poniżej 10% na ramce, 2 - między 10 a 50% na ramce i 3 wskazywało na ilość wyższą od 50% na ramce.

Ocena wirusów

Sprawdzanie każdej ramki z pszczołami odbywało się poprzez wizualne skanowane przez okres 1 minuty. W trakcie badań zespół poszukiwał także małych chrząszczy ulowych (Aethina tumida) i roztoczy Tropilaelaps żerujących na czerwiu.

Ewentualną obecność wirusów przebadano na 23 rodzinach, jednak próbki z jednej rodziny (5%) nie nadawały się do zbadania. Sugeruje się, że kwasy nukleinowe zostały zdegradowane przed lub podczas analizy. W pozostałych 22 rodzinach nie znaleziono izraelskiego wirusa ostrego paraliżu pszczół ani kaszmirskiego wirusa pszczół. Żadna rodzina nie wykazała też wirusa choroby woreczkowej, jednak 16 (72,7%) kolonii wykazało pozytywny wynik na BQCV. Drugie zrzutowanie było wykonane pod kątem DWV z użyciem tego samego wyekstrahowanego RNA. 22 na 23 kolonie (95,7%) w jednej na cztery próbki wykazały pozytywny wynik dla DWV, a wszystkie 19 rodzin, na których sekwencja była wykonana zawierały miano wirusowe DWV. Badanie polegało na wyjęciu z ula 10 dorosłych pszczół, objęciu każdej specjalnymi szczypcami i umiejscowieniu ich w probówkach (2 probówki na rodzinę) o pojemności 1,5 ml z zawartością preparatu firmy Qiagen. Płyn ten, stosowany jest do wyodrębniania DNA, RNA i białek. Fiolki były przechowywane w warunkach o temperaturze 80*C. Prof. Ostiguy w tłumaczonym protokole wyjaśnia, że wyjątek stanowił przypadek kiedy probówki przetrzymywane były w zamrażarce z suchym lodem podczas transportu z Acadia University do Uniwersytetu w Pensylwanii do diagnostyki molekularnej.

Całkowite RNA zostało wyekstrahowane przy użyciu Trizolu – mieszaniny tiocyjanianu guanidyniowego i fenolu oraz innych reagentów korporacji Invitrogen. Całość umieszczono dodatkowo w 20 mikrolitrach DEPC. Jest to woda wolna od RNAz, nazwa pochodzi od odczynnika używanego do degradacji RNAz. Odczynnikiem tym jest dietylopirowęglan, silny środek alkilujący, odporny na działanie białek, jest termo labilny. DEPC rozpada się na dwutlenek węgla, wodę oraz etanol, który w niewielkim stężeniu nie zagraża RNA. Obecność 5 wirusów próbowano wykazać przy użyciu analizy RT-PCR. Polega to na reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR, z ang. reverse transcriptase PCR). Jest to metoda powielania łańcuchów DNA polegająca na łańcuchowej reakcji polimerazy DNA w wyniku wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki, w warunkach laboratoryjnych. PCR z odwrotną transkryptazą należy do najbardziej czułych metod wykrywania niewielkich ilości cząsteczkek mRNA w próbce. Dzięki RT-PCR możliwe jest określenie ilości cząsteczek mRNA pomiędzy różnymi próbkami, określenie poziomu ekspresji oraz analizy struktury RNA.

Te same sekwencje RNA izraelskiego wirusa ostrego paraliżu pszczół były wykorzystane do wykrycia kaszmirskiego wirusa pszczół. Wykonywano też próby na BQCV. cDNA było syntetyzowane przy użyciu transkryptazy M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) czyli wirusa mysiej białaczki. Badanie PCR na obecność aktyny i wirusa choroby woreczkowej obejmowało: pierwotną denaturację przez 8 minut w temperaturze 94*C i 35 cykli w 94*C przez 55 s, 51,5*C przez 55 s, 7*C przez 1 minutę 25 s i 10 min w 72*C.

Ocena roztoczy

Ilość pasożytów acarapis woodi została oszacowana na grupie 100 losowo zabranych pszczół miodnych z 55 różnych rodzin. Próbki pszczół z pasożytami świdraczka były przygotowywane poprzez nacięcie owadów między głową a segmentem tułowia, zaraz przy skrzydle. Te pierwsze, wyodrębnione dyski zostały zanurzone w 7,5% roztworze wodorotlenku potasu przez okres 6 godzin w 75*C a następnie wyizolowane części sprawdzane były pod mikroskopem.

Intensywność warrozy (ilość roztoczy na 1 pszczołę) szacowano poprzez wstrząśnięcie 100 pszczół z jednej kolonii w okresie 3 minut w nierdzewnym, stalowym sitku, pod którym było naczynie wyłożone bawełnianym arkuszem. Odrywające się roztocza, łatwe do policzenia miały zawierać roztocza Tropilaelaps.

Ogólne obserwacje

Do badań przekazano w sumie 900 ramek z 55 pni na wyspie Nowej Funlandii. Na 55 kolonii żadna rodzina nie wykazała obecności wirusa zdeformowanych skrzydeł, 40 rodzin (73,7%) wykazało syndrom K-wing, w dwóch rojach (3,6%) zdiagnozowano grzybicę wapienną. Potwierdził się zupełny brak zgnilca amerykańskiego i europejskiego. Nie zaobserwowano również obecności chrząszczy ulowych Aethina tumida.

Próba na spory nosemozy

W celu wykazania sporów nosemozy użyto mikroskopu świetlnego. Na 55 przebadanych rodzin aż 53 (96,4%) były zainfekowane. Podczas pierwotnego badania metodą PCR wykryto w dwóch koloniach Nosemę Ceranae. Wykonano drugą próbę na 30 różnych pszczołach zabranych z podejrzanych uli i wykryto już tylko Nosemę Apis. Prawdopodobnie dwie pierwotne próbki były skażone na skutek badania obydwóch gatunków pasożytów w tym samym czasie w jednej aparaturze. Zespół badawczy postanowił upewnić się w swoich przekonaniach i ponownie przetestował próbki robotnic zebranych z tych samych uli dnia 1 października 2010 roku. Wykryto ponownie Nosemę Apis. Intensywność infekcji sięgała od 50,000 do ponad 13,000,000 sporów na pszczołę.

Ocena roztoczy

Nie wykryto jakichkolwiek pasożytów z gatunku Varroa Destructor, Tracheal (Acarapis Woodi) czy Tropilaaelaps. Syndrom K-wing był pozytywnie powiązany z BQCV, natomiast miana DWV były negatywnie powiązane z BQCV.

Wnioski

Wizualne i molekularne przeskanowanie rodzin pszczelich, zakwalifikowuje wirusa izraelskiego ostrego paraliżu pszczół, kaszmirskiego wirusa pszczół, wirusa choroby woreczkowej, spory Nosemy Ceranae, chrząszcze ulowe Aethina tumida i roztocza Tropilaspp do listy chorób, które są nie obecne na nowofundlandzkich pszczołach.

Z pojedynczych raportów pszczelarzy wynika, że przez zimę 2009/10 stracono 3 z 23 kolonii co jest równe 13,0% oraz 2 z 16 rodzin (12,5%) przez zimę 2010/11. Ilość wirusów zdeformowanych skrzydeł (spokrewnionych z aktyną) znaleziona w próbkach pszczół była niska. Jednakże kilka próbek (np. NF018, NF063, NF064) zawierało pewną liczbę tych wirusów, wartość ta sięgała od 117 do 608. Te wysokie ilości DWV przy braku warrozy są imponujące. DWV jest główną, podejrzaną przyczyną zamierania kolonii. Wirus zdeformowanych skrzydeł w obecności warrozy jest bardziej niebezpieczny dla pszczół. Dla populacji wolnej od warrozy, liczba próbek z wykrywalnymi ilościami DWV była wyższa w 23 nowofundlandzkich koloniach (59% pszczół i 83% kolonii). Wynik ten jest porównany do 3 kolonii ze Szwecji (40% pszczół i 100% kolonii).

Zespół badawczy wykrył negatywny związek pomiędzy BQCV i DWV. Wspólnym objawem dla obu wirusów był syndrom K-wing.

W dzisiejszych czasach prawie niemożliwe jest utrzymanie pasiek wolnych od pasożytów. Miałoby to olbrzymie znaczenie komercyjne i eksperymentalne. Zespół prof. Ostiguy zastrzega, że nie ma absolutnej pewności, że Nosema Ceranae jest całkowicie nieobecna w nowofundlandzkich rodzinach. Całkowicie potwierdzony został brak roztoczy Varroa Destructor, które zaraz obok sporów Nosemy Ceranae są głównymi stresorami pszczół. Nowofundlandzkie rodziny pszczele nie są transportowane na dalekie odległości, a zakupywane matki nie są importowane z terenów, gdzie pszczelarze usilnie walczą z warrozą. Dodatkowo, naukowcy wskazują na wysoką jakość odżywczą nektaru i pyłku w okolicy.

Prof. Ostiguy deklaruje, że zespół będzie kontynuował badanie relacji między różnymi patogenami i roztoczami pszczół równolegle z oddziaływaniem na nich różnych bodźców wywołujących stres (np. pestycydy). Systematyczne dostarczanie informacji mogą wspomóc utrzymanie zdrowych rodzin pszczelich.

Lider zespołu badawczego przyznaje także, że szanse na odnalezienie populacji europejskich pszczół miodnych wolnych od inwazyjnych roztoczy gwałtownie się kurczą.

Oprócz prof. Ostiguy, w badaniach biorą udział naukowcy z Uniwersytetu Acadia, Agencji Leśnictwa, Rolnictwa i Żywności, Uniwersytetu Dalhousie i Bern. Program wspiera rząd Nowej Fundlandii i Labradoru oraz amerykański Departament Rolnictwa.

Piotr Nowotnik

Bibliografia:
[link widoczny dla zalogowanych]
[link widoczny dla zalogowanych]